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Assis de Jesus
by on January 28, 2018
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Dinâmica do Nitrogênio e do Fósforo no Cultivo Superintesivo dos Camarões Litopenaeus vannamei e Farfantepenaeus paulensis sem renovação de água.

Kassio Rios da Silva Orientador: Paulo César Abreu Coorientador: Wilson Wasielesky Jr.

LISTA DE FIGURAS E TABELAS Figura 1 Modelo conceitual do balanço de massa englobando os 3 compartimentos estudados. Compartimento 1: corresponde a quantidade de N e P retida na biomassa dos camarões. Compartimento 2: Corresponde aos nutrientes orgânicos e inorgânicos dissolvidos na água do cultivo. Compartimento 3. Corresponde ao N e P particulados somados à quantidade de N e P no biofilme. ............................................................... 21 Figura 2 (A) Variação temporal na quantidade de ração adicionada nos tanques experimentais. (B) Gráfico do crescimento dos camarões Litopenaeus vannamei e Farfantepenaeus paulensis ao longo do período experimental. As barras verticais representam o desvio padrão. ...................................................................................... 22 Tabela 1 Dados de peso inicial, peso final, sobrevivência (%), conversão alimentar aparente -CAA (± desvio padrão) e taxa de crescimento específico – TCE. Letras diferentes indicam diferença significativa (teste-t, p-valor < 0,05)............................... 22 Figura 3. Variação temporal nos valores médios de pH nos tratamentos estudados (média entre os períodos da manhã e tarde). As barras verticais representam o desvio padrão. 23 Figura 4. Variação temporal nas médias diárias (manhã e tarde) dos valores de temperatura nos tratamentos estudados. As barras verticais representam o desvio padrão. .............. 24 Figura 5. Variação temporal nos valores das concentrações médias de oxigênio dissolvido nos tratamentos estudados. As barras verticais representam o desvio padrão. .............. 25 Figura 6. Variação temporal nos valores das concentrações médias de material particulado em suspensão nos tratamentos estudados. As barras verticais representam o desvio padrão. ................................................................................................................................... 25 Figura 7. Variação temporal nos valores das concentrações médias de nitrogênio amoniacal nos tratamentos estudados. A linha perpendicular ao eixo y representa o período no qual o melaço de cana foi adicionado, a seta indica o momento em que foi adicionado 20g de melaço de cana a mais do que a fertilização usual. As barras verticais representam o desvio padrão......................................................................................................................... 26 Figura 8. Variação temporal nos valores das concentrações médias de nitrito nos tratamentos estudados. As barras verticais representam o desvio padrão...................... 27 Figura 9. Variação temporal nos valores das concentrações médias de nitrato nos tratamentos estudados. As barras verticais representam o desvio padrão...................... 28 Figura 10. Variação temporal nos valores das concentrações médias de nitrogênio orgânico dissolvido nos tratamentos estudados. As barras verticais representam o desvio padrão.28 Figura 11. Variação temporal nos valores das concentrações médias de nitrogênio particulado nos tratamentos estudados. As barras verticais representam o desvio padrão.29 Figura 12. Variação temporal nos valores das concentrações médias de nitrogênio total nos tratamentos estudados. As barras verticais representam o desvio padrão...................... 30 Figura 13. Variação temporal nos valores das concentrações médias de orto-fosfato nos tratamentos estudados. As barras verticais representam o desvio padrão...................... 30 Figura 14. Variação temporal nos valores das concentrações médias de fósforo orgânico dissolvido nos tratamentos estudados. As barras verticais representam o desvio padrão.31 Figura 15. Variação temporal nos valores das concentrações médias de fósforo particulado nos tratamentos estudados. As barras verticais representam o desvio padrão. .............. 32 Figura 16. Variação temporal nos valores das concentrações médias de fósforo total nos tratamentos estudados. As barras verticais representam o desvio padrão...................... 32 Figura 17. Variação temporal na razão N:P média nos tratamentos estudados.............. 33 6 Figura 18. Razão entre nitrogênio particulado e material particulado em suspensão ao longo do período experimental. Resultados expressos em µmoles de nitrogênio particulado por grama de material particulado em suspensão. As barras verticais representam o desvio padrão......................................................................................................................... 34 Figura 19. Razão entre fósforo particulado e material particulado em suspensão ao longo do período experimental. Resultados expressos em µmoles de fósforo particulado por grama de material particulado em suspensão. As barras verticais representam o desvio padrão......................................................................................................................... 34 Figura 20. Variação temporal nos valores das concentrações médias de clorofila-a nos tratamentos estudados. As barras verticais representam o desvio padrão...................... 35 Figura 21. Variação temporal na abundância total de bactérias livres nos tratamentos estudados. Resultado expresso em 1 x 106 bactérias por mililitro. As barras verticais representam o desvio padrão. ...................................................................................... 36 Figura 22. Variação temporal na abundância de bactérias do morfotipo cocóide nos tratamentos estudados. Resultado expresso 1 x 106 em bactérias por mililitro. As barras verticais representam o desvio padrão. ........................................................................ 37 Figura 23. Variação temporal na abundância total de bactérias do morfotipo bastonete nos tratamentos estudados. Resultado expresso em 1 x 106 bactérias por mililitro. As barras verticais representam o desvio padrão. ........................................................................ 37 Figura 24. Variação temporal na abundância total de bactérias do morfotipo víbrio nos tratamentos estudados. Resultado expresso em 1 x 106 bactérias por mililitro. As barras verticais representam o desvio padrão. ........................................................................ 38 Figura 25. Variação temporal na abundância total de bactérias filamentosas nos tratamentos estudados. Resultado expresso em 1 x 106 bactérias por mililitro. As barras verticais representam o desvio padrão. ........................................................................ 38 Figura 26. Variação temporal na abundância de bactérias aderidas por micrometro quadrado nos tratamentos estudados. Resultado expresso em bactérias por micrometro quadrado de material agregado. As barras verticais representam o desvio padrão. ....... 39 Firgura 27. Variação temporal na abundância de bactérias cocóides aderidas por micrometro quadrado nos tratamentos estudados. Resultado expresso em bactérias por micrometro quadrado de material agregado. As barras verticais representam o desvio padrão......................................................................................................................... 40 Firgura 28. Variação temporal na densidade de bactérias aderidas do morfotipo bastonete por micrometro quadrado nos tratamentos estudados. Resultado expresso em bactérias por micrometro quadrado de material agregado. As barras verticais representam o desvio padrão......................................................................................................................... 40 Firgura 29. Variação temporal na densidade de bactérias filamentosas aderidas por micrometro quadrado nos tratamentos estudados. Resultado expresso em bactérias por micrometro quadrado de material agregado. As barras verticais representam o desvio padrão......................................................................................................................... 41 Figura 30. Variação temporal na abundância total de bactérias aderidas por micrometro quadrado nos tratamentos estudados. Resultado expresso em 1x 106 bactérias por mililitro. As barras verticais representam o desvio padrão.......................................................... 41 Figura 33. Balanço de massa para fósforo nos tratamentos vannamei (A) e paulensis (B) realizado nos compartimentos: 1 camarão; 2 nutrientes inorgânicos dissolvidos; 3 material particulado (maior que 0,7µmetros). Os valores estão expressos em miligramas de fósforo e por porcentagem em relação ao input proveniente da ração. Os valores fora do retângulo principal representam a quantidade de fósforo que não foi mensurada em nenhum dos compartimentos do modelo. ........................................................................................ 44 7 Figura 34. Balanço de massa para nitrogênio nos tratamentos vannamei (A) e paulensis (B) realizado nos compartimentos: 1 camarão; 2 nutrientes inorgânicos dissolvidos; 3 material particulado (maior que 0,7µmetros). Os valores estão expressos em miligramas de nitrogênio e por porcentagem em relação ao input proveniente da ração...................... 43 Tabela 2. Quantidade de nitrogênio e fósforo produzida por tonelada de camarão cultivado em diferentes densidades............................................................................................. 53 8 Aos meus pais e para Marianna a garota mais extraordinária deste mundo! 9 AGRADECIMENTOS A CAPES pela concessão da bolsa de Mestrado. Aos membros da banca pelas valiosas sugestões. Ao meu coorientador Prof. Dr. Wilson Wasielesky Jr. pelas correções e apoio durante a realização do experimento. Ao meu orientador Prof. Dr. Paulo Cesar Oliveira Vergne de Abreu, pela orientação, ensinamentos e principalmente pela paciência e boa vontade durante todo o período da realização deste manuscrito. A todos os professores que tive durante minha vida, principalmente para aqueles que exercem a profissão com entusiasmo e tornaram as disciplinas agradáveis e interessantes. Aos amigos(as) da EMA pelo companheirismo, amizade e apoio durante a realização do experimento. Sem falar no futebol e nos churrascos! Aos colegas do Labfito, em especial ao Arnaldo ao José ao Cabeção e a Vanessa pela ajuda durante o experimento e nas análises no laboratório. A todos os demais amigos queridos que me apoiaram com muita alegria e amizade: Jack, Camilão, Sami San, Boto, João, Jack, Ricardo, Pedrão, Lú, Renatão, Sabrina, Paulinha, Gabi, Natan, Diogão, Lisa, Lise entre muitos outros que não estão citados, mas que também mereciam estar aqui. A Marianna, pela parceria, amor e amizade, e, sobretudo, pela paciência e apoio nos momentos difíceis de desânimo e cansaço. Muito obrigado por estar ao meu lado e me fazer tão feliz. E, principalmente, à minha família que eu amo muito, pela educação, apoio, amor e confiança. 10 RESUMO O presente trabalho teve como objetivo acompanhar a dinâmica do nitrogênio e do fósforo em um sistema de cultivo super-intensivo sem renovação de água (Zero Exchange Aerobic Heterotrophic System - ZEAH) dos camarões marinhos de duas diferentes espécies: Litopenaeus vannamei e Farfantepenaeus paulensis. Para tal foi realizado um experimento ao longo de 42 dias que consistiu em 3 tratamentos: 1) TV – estocado com juvenis de L. vannamei com 0,12g de peso inicial e densidade de 300 cam/m2 , 2) TP - com juvenis de F. paulensis com 0,13g de peso inicial e densidade de 300 cam/m2 e 3) TC – sem camarão, apenas com a adição de ração. Os tratamentos tinham três repetições compostos de tanques de 210 litros de volume útil e 0,33m2 de área de fundo. Variáveis físicas e químicas como pH, salinidade, temperatura, oxigênio dissolvido foram monitorados diariamente (manhã e tarde). Os nutrientes (nitrogênio amoniacal, nitrito, nitrato, nitrogênio particulado, nitrogênio total, ortofosfato, fósforo particulado e fósforo total), material particulado em suspensão, clorofila-a e microorganismos foram monitorados a cada 3 dias e no final do experimento foi realizado um balanço de massa para nitrogênio e fósforo. O sistema ZEAH se mostrou bastante eficiente na mobilização da amônia. A oxidação da amônia pelas bactérias nitrificantes foi o principal processo de remoção deste nutriente, sendo que o nitrato correspondeu a mais de 80% do nitrogênio inorgânico dissolvido em todos os tratamentos estudados. Do total de N e P adicionado pela ração os camarões absorveram 42% do N e 35% do P no TV e 21,5% do N e 16% do P no TP, estes valores elevados indicam que os camarões conseguem aproveitar melhor os nutrientes no sistema ZEAH, se comparado a outros sistemas de cultivo. O acúmulo de ortofosfato foi mais intenso no TP em relação ao vannamei. Cerca de 35% do fósforo adicionado pela ração foi medido como ortofosfato neste tratamento. O aumento na disponibilidade do fósforo pode ocasionar problemas ao cultivo de camarões, como o surgimento de cianobactérias nocivas. Desta forma, algumas medidas de tratamento de da água de cultivo para a remoção deste nutriente são apresentadas. 11 ABSTRACT This study aimed to monitor the nitrogen and phosphorus dynamics in the super-intensive aerobic heterotrophic system (ZEAH) rearing two different species: L. vannamei and F. paulensis. For this an experiment consisting of 3 treatments: : 1) vannamei treatment – stocked with L. vannamei juveniles (0.12 g initial weight and density of 300 shrimp/m2 ); 2) paulensis treatment - with F. paulensis juveniles (0.13 g initial weight and 300 shrimp/m2 density and 3) control treatment – where only feed were added with no shrimp stocked. The experiment was performed along 42 days. All treatments were conducted in triplicate. The experimental units consisted of 9 fiber glass tanks of 210 liters of useful volume and 0.33 m2 of botton area. Physico-chemical variables like salinity, temperature, dissolved oxygen and pH, nutrients (total ammonia nitrogen, nitrite, nitrate, particulate nitrogen, total nitrogen, soluble reactive phosphorus, particulate phosphorus and total phosphorus), total solids , chlorophyll-a and microorganisms were monitored every 3 days. A N and P mass balance was performed at the end of the experiment. The ZEAH system showed to be very efficient in the ammonium elimination. The ammonium oxidation by by nitrifying bacteria was the predominant processes in the ammonium removal . At day 42 the nitrate concentration represented more than 80% of total dissolved inorganic nitrogen in all treatments. Shrimp absorbed 42% of N and 35% of P in the vannamei treatment and 21.5% of N and P in 16% in treatment paulensis. These high values suggest that shrimp feeds on the microbial flocs. The accumulation of soluble reactive phosphorus (SRP) in treatment paulensis was greater than on vannamei. About 35% of phosphorus inputs are accumulated as SRP. The increase in the orthophosphate concentration can cause some problems to the rearing system as cyanobateria blooms. Therefore, several suggestion of ZEAH water treatment are presented. 12 1. INTRODUÇÃO Segundo dados da FAO (2006, 2008), nas últimas décadas o cultivo de organismos aquáticos cresceu em média 8,8% ao ano, atingindo produção anual de aproximadamente 45,5 milhões de toneladas em 2004, com previsão de 83 milhões de toneladas para 2030. De acordo com Cuzon et al. (2004), o hemisfério ocidental produziu 132.000 toneladas de camarão em 1998 e 271.000 toneladas em 2003. Nesse mesmo ano, o Brasil atingiu uma produção de 90.120 toneladas com produtividade média acima de 6000 kg/ha/ano (Rocha et al., 2004). Entretanto, certas precauções são necessárias para garantir a sustentabilidade desta atividade. A eutrofização de ambientes aquáticos por efluentes de cultivo, a introdução de espécies exóticas e a utilização de proteína de origem marinha são apontadas como os maiores impactos produzidos pela aqüicultura (Avnimelech, 2006, FAO, 2006, Lacerda et al., 2006, Naylor et al. 2000, Sena et al. 2006). Outro problema, enfrentado especificamente pelos carcinocultores, é a incidência de doenças como a síndrome da mancha branca (“white spot syndrome virus - WSSV”) (Lightner, 1999) que, podem ocasionar a diminuição da produção (Schwab & Lehmann, 2003). A ocorrência de enfermidades está principalmente associada à baixa qualidade da água em cultivos intensivos e a captação da água proveniente de locais onde outros produtores liberaram seus efluentes (Kautsky et al., 2000). Historicamente, os cultivos intensivos de camarões se utilizaram de alta taxa de renovação de água para garantir a qualidade do meio de cultivo, liberando, via efluentes, cargas significativas de nutrientes e matéria orgânica (Lacerda et al. 2006, Boyd & Clay, 1998). Os efluentes provenientes de cultivos podem contribuir para a eutrofização de ambientes aquáticos de duas maneiras: 1) pela adição de matéria orgânica e/ou 2) pelo estimulo à produção de matéria orgânica pela adição de nutrientes inorgânicos dissolvidos como N e P (Cho et al., 1991 e Phillips et al., 1993 apud Thoman et al. 2001). Em ecologia, chama-se eutrofização o processo causado pelo excesso de nutrientes (compostos químicos ricos em fósforo e/ou nitrogênio, normalmente causado pela descarga de efluentes agrícolas, urbanos ou industriais) num corpo de água mais ou menos fechado, o que leva à proliferação excessiva de algas, que, ao entrarem em decomposição, levam ao aumento do número de microorganismos e à conseqüente deterioração da qualidade do corpo de água (Wikipédia, 2009). 13 Atualmente, com o aumento da cobrança por parte dos órgãos ambientais e pelo risco de contaminação por patógenos, existe um interesse em buscar sistemas alternativos que garantam alta produtividade, baixo risco de contaminação e o mínimo de impacto ambiental. Uma maneira de evitar a eutrofização é diminuir a carga de nutrientes no efluente (Thoman, 2001) ou utilizar o sistema “ZEAH” (Zero exchange aerobic heterotrofic system). Os princípios para a utilização de sistemas sem renovação ZEAH (ou renovação mínima) de água foram desenvolvidos concomitantemente em Israel, focando no cultivo de tilápias (Avnimelech et al., 1989, Avnimelech et al.,1994), e nos Estados Unidos da América voltado ao cultivo do camarão-branco Litopenaeus vannamei (Hopkins et al., 1993, Chamberlain & Hopkins, 1994). Entre as principais vantagens deste sistema estão à facilidade na implementação de estratégias de biosegurança (Moss, 1999), a possibilidade redução nos níveis de proteína da dieta (Burford et al., 2004, Ballester et al. 2009), e a redução ou eliminação dos impactos ambientais provocados pelos efluentes (Browdy et al., 2001). Todavia, apesar das vantagens proporcionadas pelo sistema “ZEAH”, é necessária uma alta densidade (> 200 cam/m2 ) de estocagem para garantir sua viabilidade econômica (Van Wik, 2001, apud Weirich, 2002). Nitrogênio e fósforo são produzidos em grandes quantidades em sistemas intensivos, podendo causar eutrofização acentuada do corpo de água receptor dos efluentes (Hakanson et al., 1998). A principal fonte de nitrogênio e fósforo é proveniente da excreção e da decomposição da ração não ingerida. Kibria et al. (1996), relatam que na maioria das rações comerciais os níveis de fósforo estão acima das exigências nutricionais, ou estão em formas indisponíveis. Alem disso, os camarões necessitam de alta concentração de proteína na dieta para suprir suas necessidades em aminoácidos essenciais e energia, sendo o produto da catálise protéica excretado principalmente, sob a forma de amônia. Na dieta, o fósforo é necessário para a obtenção de um crescimento ótimo e melhor eficiência alimentar atuando principalmente na regulação ácido-base, na formação do exoesqueleto e no armazenamento de energia (Richel & Ebeling, 2006). A ciclagem biogeoquímica do nitrogênio e do fósforo em ambientes aquáticos naturais é um processo complexo envolvendo os compartimentos orgânico e inorgânico, assim como as formas dissolvida e particulada (Carmouze, 1994). Em sistemas ZEAH torna-se mais fácil a análise dos fluxos entre os compartimentos citados acima, uma vez que não existe renovação de áuga. Diversos autores investigaram o efeito da relação C: N 14 no desenvolvimento dos agregados microbianos e absorção de nitrogênio nestes sistemas (Avnimelech, 1999, Avnimelech 2006, Burford et al. 2003, Ebeling et al., 2006,). O nitrogênio é removido de sua forma dissolvida (NH4 + + NH3, NO2 - e NO3 - ) por quatro vias: nitrificação, desnitrificação, volatilização da amônia gasosa (NH3) e assimilação por organismos fotoautotróficos e por bactérias heterotróficas (quimio-organotróficas). Nos sistemas ZEAH a razão C:N é aumentada, através da adição de carboidrato, para favorecer assimilação de nitrogênio (principalmente na forma de amônio) pelas bactérias heterotróficas e promover a formação do floco microbiano que pode contribuir com uma parcela significativa na nutrição dos camarões peneídeos (Burford et al. 2004, Tacon et al. 2002). Ao contrario do nitrogênio, o fósforo não apresenta nenhuma rota de saída do sistema, sendo comumente retirado por métodos físicos, químicos ou biológicos. No ambiente natural o fósforo é adsorvido pelos íons Fe+3 e Ca+2 ou por partículas de argilominerais e matéria orgânica. As principais variáveis físico-químicas envolvidas na adsorção/dessorção do fosfato são o potencial redox e o pH (Alongi, 1997). De uma maneira geral o fósforo tende a ser adsorvido em ambientes aeróbicos e dessorvido em ambientes anóxicos (Baumgarten et al, 2001). Nos sistemas de cultivo de peixes e crustáceos, os estudos sobre o fósforo são principalmente voltados ao tratamento de efluentes (Porello et al. 2003, Rishel et al. 2006) devido ao alto poder de eutrofização deste macroelemento, principalmente em ambientes límnicos, e a sua baixa toxicidade no meio de cultivo de tal forma que informações sobre a ciclagem deste nutriente no sistema ZEAH são escassas. Entretanto, apesar de sua baixa toxidez o fósforo, em altas concentrações, pode favorecer o florescimento de cianobactérias que provocam a obstrução das brânquias dos camarões e interferem no desenvolvimento do floco bacteriano prejudicando o bom desenvolvimento do cultivo. Já o nitrogênio foi objeto de estudo de diversos autores nos últimos anos, principalmente devido à toxidez da amônia e do nitrito, que são apontados como entraves para o desenvolvimento de cultivos superintensivos (Wasielesky et al.,1994, Thompson et al., 2002; Burford et al. 2003, Jackson, 2003, Avnimelech, 2007). Mais recentemente, Ferreira (2007) observou que diferentes espécies de camarão (Litopenaeus vannamei e Farfantepenaeus paulensis) cultivadas em sistema ZEAH influenciam de maneira marcante a disponibilidade de nutrientes e a comunidade microbiana presente na água de cultivo. Foram encontradas diferenças nas quantidade de nutrientes e agregados nos tratamentos contendo espécies diferentes. Estas diferenças 15 dependem, provavelmente, da taxa de excreção e das proporções em que N e P são excretados pelos camarões após o consumo de ração. Questões como fisiologia, necessidades nutricionais e qualidade e especificidade da ração foram apontadas como fatores geradores destas diferenças. O entendimento dos processos de ciclagem destes macronutrientes nos compartimentos do sistema ZEAH é de fundamental importância para fomentar ações de remoção de nutrientes, assim como para a implementação de sistemas integrados de recirculação e ao tratamento da água nos períodos de entressafra evitando o lançamento de efluentes. Entretanto, não temos conhecimento de qualquer trabalho que tenha caracterizado os diferentes compartimentos (camarão, água e partículas) e formas (particulada e dissolvida; orgânica e inorgânica) de nitrogênio e fósforo, nem realizado um balanço de massa destes nutrientes no sistema ZEAH. 1.1 Objetivos Objetivo geral:  Caracterizar as vias de aporte, remoção e transferência nos compartimentos (camarão, água e material particulado) de nitrogênio e fósforo, no cultivo dos camarões L. vannaamei e F. paulensis, em sistema ZEAH. Específicos:  Determinar as principais formas (particulada e dissolvida; orgânica e inorgânica) e compartimentos (camarão, água e partículas) em que N e P ocorrem no sistema ZEAH durante o cultivo do camarão-branco L. vannamei e do camarão-rosa F. paulensis..  Realizar um balanço de massa para nitrogênio e fósforo durante o cultivo de duas espécies de camarões L. vannamei e F. paulensis.  Verificar quais os principais processos envolvidos na ciclagem do nitrogênio e do fósforo dentro do sistema ZEAH.  Fornecer subsídios para o manejo da água no período entressafra para o reaproveitamento em ciclos posteriores. 16 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Local do experimento O experimento foi realizado na Estação Marinha de Aquacultura Prof. Marcos Alberto Marchiori (EMA), localizada na Praia do Cassino (32º12´S e 51º50` W), município do Rio Grande-RS. 2.2 Desenho experimental O experimento foi realizado com três tratamentos, com três repetições cada: 1- Tratamento controle (TC) - sem camarão, somente com adição de ração; 2- Tratamento paulensis (TP) –cultivo do camarão-rosa Farfantepenaeus paulensis, com flocos e adição de ração; 3- Tratamento vannamei (TV) - cultivo do camarão-branco Litopenaeus vannamei, com flocos e adição de ração. As unidades experimentais foram constituídas de nove tanques (310 L de volume cada). Nas unidades foi montado um sistema de aeração constante, para ressuspensão do material particulado. O experimento foi conduzido por 42 dias sem renovação de água. A reposição da água decorrente da evaporação foi feita com água da companhia de abastecimento municipal (CORSAN), previamente desclorada. Os tanques com camarões foram estocados a uma densidade de 300 cam/ m2 com peso inicial de aproximadamente 0,12 g. Os camarões juvenis de F. paulensis foram obtidos da larvicultura realizada na Estação Marinha de Aqüicultura (EMA-FURG), enquanto os juvenis de L. vannamei foram obtidos a partir de náuplios adquiridos do laboratório comercial de produção de larvas e pós-larvas (Aquatec ®). 2.3. Preparação do meio de cultivo Três dias antes do povoamento foram inoculadas células da diatomácea Thalassiosira weissflogii na concentração de aproximadamente 3 x104 células/mL para fornecer substrato para a formação dos agregados e logo após dar-se inicio ao experimento fazendo a indução do floco e povoando os tanques. O processo de indução seguiu a abordagem proposta por Avnimelech (1999) na qual a adição de carboidrato é proporcioanal à quantidade teórica de nitrogênio excretada pelos camarões e/ou 17 remineralizada pelas bactérias. De acordo com este mesmo autor o fluxo de nitrogênio para o sistema pode ser considerado equivalente a 50% do total adicionado pelo arraçoamento. Desta maneira: ∆N = ∆Ração X %Nração X % Nexcretado/remineralizado (Eq. 1) Onde: ∆N = Quantidade de nitrogênio amoniacal (em massa) no tanque ∆Ração = Quantidade de ração ofertada %Nração = Porcentagem de nitrogênio na ração % Nexcretado/remineralizado = Porcentagem do nitrogênio proveniente da ração que não é assimilado pelos camarões. Após o cálculo da quantidade de nitrogênio proveniente da excreção/remineralização calcula-se a quantidade de carboidrato a ser adicionada no sistema pela equação: ∆Carboidrato = ∆N / (%C x E / C:Nmic) (Eq. 2) Onde:  %C = porcentagem de carbono no carboidrato  E = eficiência bacteriana em transformar carbono em biomassa  C:Nmic = razão carbono:nitrogênio na célula bacteriana. No presente estudo foi utilizado o melaço de cana como fonte de carbono e foram assumidos os seguintes valores para os parametros acima: %C = 50; E = 0,4 (Gaudy & Gaudy, 1980); C:Nmic = 4 (Gaudy & Gaudy, 1980). Durante os 4 primeiros dias foi adicionado farelo de trigo a uma taxa de 10% do total de melaço de cana para servir de substrato para a fixação de bactérias. Após este período foi efetuada uma pausa na adição de carbono até um posterior aumento na concentração de nitrogênio amoniacal atingir 40 µM e só então se prosseguiu com a fertilização com melaço de cana, como descrito nos parágrafos acima. Sempre que a concentração de nitrogênio amoniacal ultrapassou 40 µM eram adicionados uma quantidade extra de melaço de cana seguindo a equação 2. O valor de 40 µM foi adotado pois encontra-se abaixo do nível de segurança para o cultivo das espécies L. vannamei (Van Wyk & Scarpa, 1999) e F. paulensis (Wasielesky, 2000) mantendo o cultivo em condições favoráveis para o crescimento dos camarões. 18 2.4. Alimentação das Pós-larvas Os camarões foram alimentados com ração Poty Mar © contendo 38% de proteína bruta a uma taxa de 10% da biomassa ao dia, dividida em dois intervalos (09:00 e 17:00hs), no TC foi adicionada uma quantidade equivalente à média aritimética dos tratamentos TP e TV. 2.5. Amostragem A salinidade (refratômetro de mão AO-Scientific Instruments Warnner – Lambert, precisão ± 1, escala de 1 a 100), temperatura (termômetro de mercúrio, precisão ± 1 oC) e o pH (pHmetro Handylab 2 BNC marca SCHOTT, precisão ± 0,1 ) foram medidos in situ diariamente. A concentração de oxigênio dissolvido foi mensurada in situ pelo oxymetro HandyLab OXI/SET marca Schott, precisão ± 0,01. As amostras de água para determinação das frações de nitrogênio e fósforo inorgânico dissolvido (NID e PID), nitrogênio e fósforo orgânico dissolvido (NOD e POD), nitrogênio e fósforo orgânico particulado (NOP e POP) e material particulado em suspensão (MPS) foram coletadas a cada 72 horas, acondicionadas em frascos de polietileno (500 mL), resfriadas e encaminhadas para análise no Laboratório de Ecologia de Fitoplâncton e de Microorganismos Marinhos – FURG. O material biológico foi coletado a cada 3 dias para quantificar (número e volume) dos microorganismos (bactérias) presentes no meio de cultivo e determinar a biomassa fitoplanctônica. Este material foi fixado com formalina 4% e posteriormente analisado no Laboratório de Ecologia do Fitoplâncton e Microorganismos Marinhos – FURG. 2.6. Medidas de Nutrientes e Material Particulado em Suspensão (MPS) As amostras para a determinação do MPS serão filtradas em filtros GF 52C (Schleicher & Schuell) imediatamente após a chegada no laboratório e os filtros armazenados a -20 C até posterior determinação pelo método gravimétrico descrito em Strickland & Parsons (1972), sendo o filtrado utilizado para análise de nitrito, nitrato (Strickland & Parsons, 1972), nitrogênio amoniacal (UNESCO, 1983) e PID (ortofosfato) pelo método colorimétrico (Strickland & Parsons, 1972) e o material retido no filtro 19 utilizado para análise de nitrogênio e fósforo particulado (NP e PP) (Carmouze, 1994, Valderrama, 1994). Para a determinação de nitrogênio e fósforo total (NT e PT), foram utilizadas alíquotas de 50mL e analisadas pelo método de digestão com persulfato de potássio (Valderrama, 1994), seguidas por leitura colorimétrica sob a forma de nitrato ou fosfato como descrito em Strickland & Parsons (1972). As frações de NOD e POD serão obtidas pelas equações: NOD = NT - NID – NP POD = PT - PID - FP 2.7. Análises Biológicas Para determinação da abundância de bactérias, cianobactérias e flagelados, subamostras de 0,3 mL foram filtradas em filtros de membrana de policarbonato (Nucleopore 0,2µm de poro e 2,5nm de diâmetro), previamente escurecidos com Irgalan Black. Os microorganismos foram corados com DNA intercalating dye 4,6 diamino-2 phenylindole (DAPI), na concentração de 15µg/mL (adaptado de Porter & Feig, 1980) e posteriormente fotografados, utilizando-se do microscópio de epifluerescência Zeiss Axioplan, equipado com um conjunto de filtros de luz 487703 (BP365/11; FT 395; LP 397) com magnificação de 1000x acoplado a uma câmera de vídeo CCD Watec (sensibilidade luminosa 0,0003 lux). O software ImageCaputre © foi utilizado para captura das imagens. Para a contagem e determinação de biovolume e biomassa bacteriana utilizou-se o software UTHSCSA ImageTools disponível em http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/download.html ). Para contagem dos protozoários (flagelados e ciliados), 0,1 a 1mL da amostra foi colocada na câmara de sedimentação por aproximadamente 2h para posterior contagem, utilizando microscópio invertido (Zeis Axiovert). A concentração de clorofila a foi medida a partir de uma amostra de 50mL de água concentrada em filtro de fibra de vidro Whatman GF/F. Os filtros foram colocados em frascos com 10 mL de acetona 90% v /v e deixados a -18ºC por 24h, para extração da clorofila-a. A concentração do pigmento foi determinada por fluorímetro (Turner TD700) de acordo com a metodologia descrita em Welschmeyer (1994). 20 2.8. Determinação de nitrogênio e fósforo nos microorganismos O conteúdo de nitrogênio e fósforo contido nas bactérias e protozoários foi determinado pela equação: Nb = B x (Fn ou Fp) x BVmédio onde B = abundância média das bactérias; Fn ou Fp = conteúdo médio de nitrogênio ou fósforo normalizado para células de 1 µ m-3 e BVmédio o volume médio das bactérias, sendo o resultado expresso em pgN e pgP. O conteúdo de nitrogênio é calculado considerando-se um valor de Fn de 19,67 p g N m -3 (Vrede et al, 2002) e de fósforo calculado utilizando-se a constante Fp (6,74 p g N m-3 ) (Vrede et al, 2002). A quantidade de nitrogênio e fósforo nas microalgas foi determinada de maneira indireta, pela relação carbono/clorofila (50:1) (Proença, 1990). Obtida a quantidade de carbono utiliza-se a razão de Redfield (106C:16N:1P – Redfield et al. 1967) para obter-se o resultado em termos de nitrogênio e fósforo. 2.9. Balanço de massa O balanço de massa foi determinado pela diferença entre o aporte e a saída de material no sistema. Seguindo o princípio da conservação de massa, toda a matéria que entra em um sistema deve sair ou então ser aí acumulada. No presente estudo a ração e o melaço de cana, foram os únicos aportes e a desnitrificação e volatilização da amônia gasosa as únicas saídas de N do sistema, enquanto que o P deve apresentar um acúmulo constante, uma vez que não há produção de efluentes. Outras possíveis fontes de N e P, como a água de reposição e o melaço de cana foram considerados desprezíveis, baseados em análises prévias e não entraram nos cálculos do balanço de massa. O balanço de massa foi realizado para determinar a capacidade de retenção do nitrogênio e do fósforo nos compartimentos (1,2,3) do sistema ZEAH (Figura 1) de acordo com as equações:  Nração = Ncamarão + NID + NP + (volatilização e desnitrificação) - Ninicial  Pração = Pcamarão + PID + PP – Pinicial Onde: N ou Pcamarão é a quantidade do respectivo nutriente no camarão, NID ou PID é a quantidade do nutriente dissolvido na água, NP ou PP se refere à quantidade de nitrogênio ou fósforo na forma particulada somada a quantidade de N e P presente no biofilme aderido a parede dos tanques. A quantidade de N e P presente no biofilme foi calculada 21 com base nos dados obtidos no trabalho de Ballester et. al (2006) (Clorofila-a no biofilme: 6,2 µg Cl-a / cm2 ) assumindo 2.808 cm2 de área colonizada por biofilme por unidade experimental. O N ou Pinicial se refere à quantidade inicial do nutriente medida no dia 0. A quantidade de nitrogênio que sairá do sistema por volatilização da amônia gasosa e desnitrificação foi calculada pela diferença entre o input total de nitrogênio e a quantidade armazenada no sistema.

Figura 1 Modelo conceitual do balanço de massa englobando os 3 compartimentos estudados. Compartimento 1: corresponde a quantidade de N e P retida na biomassa dos camarões. Compartimento 2: Corresponde aos nutrientes orgânicos e inorgânicos dissolvidos na água do cultivo. Compartimento 3. Corresponde ao N e P particulados somados à quantidade de N e P no biofilme. As quantidades de nitrogênio e fósforo nos camarões, na ração, no melaço de cana e no farelo de trigo foram determinadas por análise de composição proximal realizada conforme descrito em AOAC (Cunniff, 1998), pelo laboratório de Nutrição Animal da Universidade Federal de Pelotas (RS). O conteúdo de nitrogênio e/ou fósforo do floco microbiano foi determinado pela quantidade de nitrogênio e fósforo particulado (NP, PP).

3. RESULTADOS 3.1 Quantidades de nitrogênio e fósforo na ração e nos camarões

A quantidade de nitrogênio e fósforo nos camarões e na ração foi determinada por análise proximal e, no caso da porcentagem de fósforo na ração, por oxidação com persulfato. As porcentagens de N e P encontradas na ração foram de 6,09 ± 0,45% e 0,8 ± 0,01%, respectivamente (n = 3). Nos camarões da espécie L. vannamei e F. paulensis, os teores foram de 2,14 ± 0,11 % e 1,85 ± 0,17% para nitrogênio, e 0,23 ± 0,018% e 0,18 ± 0,008% para fósforo, respectivamente (n = 3). A porcentagem de N no melaço foi de 0,8 ± 0,02%. 3.2 Índices zootécnicos Os camarões apresentaram diferença significativa no peso médio (teste-t, p-valor < 0,05) a partir do décimo oitavo dia de experimento, com o TV apresentando os maiores valores (Figura 2, A). O camarão Litopenaeus vannamei apresentou peso médio final de 2,2g, i.e, 3,7 vezes superior aos camarões do TP (peso final de 0,55g). A quantidade de ração adicionada por dia nos 3 tratamentos do experimento pode ser observado no gráfico B da figura 2, o montante de ração adicionado até o final do experimento foi 190,4 g no TV, 96,4 g no TP e 130g de ração no tratamento controle. A diferença entre o peso inicial e final, a conversão alimentar aparente, a taxa de crescimento específico e a taxa de sobrevivência para as duas espécies de camarão estão apresentadas na tabela 1. Figura 2. (A) Gráfico do crescimento dos